FLUOSYNC 一種快速而溫和的多色光譜拆分寬場(chǎng)熒光成像方法
更新時(shí)間：2022-02-18 點(diǎn)擊次數(shù)：1086
作者Johannes Amon博士Peter Laskey博士，徠卡顯微系統(tǒng)公司FluoSync 是一種使用單次曝光同時(shí)進(jìn)行多通道熒光成像的精簡(jiǎn)方法。傳統(tǒng)的熒光成像方法通常按順序?qū)γ總€(gè)通道成像，以減少熒光團(tuán)之間的串?dāng)_。之前已單獨(dú)介紹了多光譜成像以及后續(xù)的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。每一種方法都需要進(jìn)行繁瑣的手動(dòng)調(diào)整或深入理解底層技術(shù)，或兩者都需要。徠卡顯微系統(tǒng)通過(guò)FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復(fù)雜性的同時(shí)保留了快速溫和成像的優(yōu)點(diǎn)。FluoSync 會(huì)捕捉整個(gè)可見(jiàn)光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個(gè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)可靠的通道分離。多通道熒光成像從未如此容易。多色寬場(chǎng)顯微成像熒光顯微成像為研究蛋白質(zhì)及其他生物分子的細(xì)胞功能提供了一種強(qiáng)大的工具。它具有能標(biāo)記和跟蹤高特異性靶分子的*能力，因此已成為生命科學(xué)研究中不可少的一種工具。 抗體和遺傳標(biāo)記可使用光譜可分辨的熒光染料來(lái)靶向和標(biāo)記分子（見(jiàn)圖 1）。通過(guò)組合使用這些熒光標(biāo)記，用戶(hù)可以跟蹤和研究樣本中不同標(biāo)記的分子群體之間的行為和相互作用。常見(jiàn)的多色熒光成像方法需要考慮到熒光團(tuán)信號(hào)的光譜重疊，這種現(xiàn)象通常稱(chēng)為串?dāng)_或串色，如圖 1b 所示。通常，研究人員可通過(guò)將樣本中的染料數(shù)量保持在最少限度（即最多一種或兩種染料）來(lái)避免串?dāng)_，因?yàn)闃颖局惺褂玫娜玖显蕉啵l(fā)生信號(hào)串?dāng)_問(wèn)題的可能性就越大。 但是，隨著對(duì)生物學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)需求的日益增長(zhǎng)，研究人員需要在一個(gè)樣本中觀察三個(gè)或更多事件，因此這種過(guò)于簡(jiǎn)單的方法不再適用。在典型的多通道實(shí)驗(yàn)中，通常使用一種或兩種熒光染料來(lái)識(shí)別特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如細(xì)胞核或線粒體，再使用額外的染料來(lái)識(shí)別感興趣的蛋白質(zhì)。光譜分離和拆解在多通道方法中通常需要使用光譜分離良好的染料組合。如圖 1 所示，Alexa 488 與 Alexa 555 的組合就是一個(gè)很好的例子，兩者分別在光譜的綠色和紅色部分發(fā)光。但是，在使用多個(gè)熒光團(tuán)染色的樣本中，對(duì)染料進(jìn)行光譜分離通常并不容易。染料的發(fā)射曲線可能部分重疊，導(dǎo)致一種染料發(fā)出的部分熒光信號(hào)落入其鄰近光譜的探測(cè)窗口。換句話(huà)說(shuō)，來(lái)自綠色染料的一些信號(hào)會(huì)串色到紅色通道。在活細(xì)胞成像中這個(gè)問(wèn)題可能更嚴(yán)重，因?yàn)橛脩?hù)為了避免光毒性會(huì)嘗試避開(kāi)光譜的藍(lán)色端。研究人員仍然需要使用多種染料來(lái)標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)，但是受限于較窄的光譜區(qū)域，這增加了潛在的串?dāng)_問(wèn)題。有兩種常用的方法可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行光譜分解：使用特定的窄帶通光學(xué)濾色鏡和線性拆分（也稱(chēng)為多光譜或高光譜成像）進(jìn)行分離。使用特定的窄帶通光學(xué)濾色鏡進(jìn)行通道分離簡(jiǎn)單的多通道方法是按順序?qū)θ玖铣上?。使用這種方法時(shí)，單獨(dú)激發(fā)樣本中的每種染料并探測(cè)其發(fā)射光。激發(fā)波長(zhǎng)通過(guò)激發(fā)濾色鏡或特定波長(zhǎng)的 LED 進(jìn)行控制。熒光濾色塊中的帶通光學(xué)濾色鏡被移至每個(gè)圖像的光路中，以檢查到達(dá)樣本和探測(cè)器的光譜。最終的復(fù)合多色圖像是通過(guò)疊加單獨(dú)的曝光而產(chǎn)生的。按順序激發(fā)染料有助于減少串?dāng)_問(wèn)題，但不能*將其消除。這種方法可能太慢，無(wú)法對(duì)快速的細(xì)胞事件成像，例如囊泡跟蹤或鈣成像。通常，感興趣的對(duì)象在兩個(gè)通道之間移動(dòng)，因此如果不同時(shí)采集兩個(gè)通道，就無(wú)法在兩個(gè)通道中有效跟蹤該對(duì)象。此外，對(duì)多孔板等大型樣本成像時(shí)，長(zhǎng)采集周期會(huì)顯著增加實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行時(shí)間，導(dǎo)致工作效率下降。為了加快采集過(guò)程，可以使用 Sedat 和 Pinkel 配置，將多帶通熒光濾色塊與快速的濾光片輪結(jié)合使用。這種小型濾光片輪的切換速度比熒光濾色塊快得多。多帶通熒光濾色塊會(huì)阻擋來(lái)自窄發(fā)射窗口之外的染料的熒光發(fā)射，因此可能會(huì)丟失寶貴的信號(hào)（參見(jiàn)圖 1a）。該技術(shù)還可能增加樣本光漂白，并降低最終圖像中的時(shí)間分辨率和信噪比水平。線性拆分另一種分離染料的方法是線性拆分，它使用數(shù)學(xué)拆分方法來(lái)分離通道。在這種方法中，顯微鏡收集樣本的多個(gè)圖像，每個(gè)圖像涉及不同的光譜帶（參見(jiàn)圖 2）。 所收集的數(shù)據(jù)包含每個(gè)像素的光譜曲線，以及來(lái)自所有熒光團(tuán)的組合發(fā)射光譜。 接下來(lái)使用光譜線性拆分來(lái)量化每一群熒光團(tuán)對(duì)信號(hào)的貢獻(xiàn)，然后生成多通道圖像。 在寬場(chǎng)成像中，該技術(shù)稱(chēng)為多光譜成像。 在共聚焦成像中，系統(tǒng)通常可以用較高光譜分辨率進(jìn)行掃描，這種方法稱(chēng)為高光譜成像或蘭布達(dá)掃描。 除非您擁有能夠同時(shí)捕捉多個(gè)光譜窗口的專(zhuān)用硬件，否則這種方法需要對(duì)樣本反復(fù)曝光，導(dǎo)致有的光脅迫，因此不適合活細(xì)胞成像。線性拆分要求樣本中的每種染料有一個(gè)已知的參考光譜。 理想情況下，使用相同類(lèi)型的樣本和制備方法采集參考光譜，以便系統(tǒng)能夠?qū)⑷玖闲盘?hào)與樣本*的背景噪聲和自發(fā)熒光區(qū)分開(kāi)。線性拆分的基礎(chǔ)是將校準(zhǔn)曲線中的信號(hào)水平與從真實(shí)樣本中采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。 如果染料濃度不同，即來(lái)自一個(gè)通道的信號(hào)比另一個(gè)通道的亮得多，可能會(huì)導(dǎo)致拆分誤差。 此外，如果存在探測(cè)器或光學(xué)噪聲（樣本背景熒光），還可能導(dǎo)致引入更多誤差來(lái)源。 這些弱點(diǎn)可能意味著線性拆分不適合光照強(qiáng)度低、背景噪聲高的樣本以及通道之間強(qiáng)度明顯不同的樣本。
圖 1a。 Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個(gè)發(fā)射光譜的重疊顯而易見(jiàn)。 紅線表示 488 發(fā)射光濾光鏡的帶通。 只有在這條線下擬合的發(fā)射波長(zhǎng)才能使其通過(guò)濾光鏡到達(dá)探測(cè)器。 紅色陰影區(qū)域顯示了 488 信號(hào)的一部分 (~20%) 被濾光鏡阻擋，減少與相鄰染料發(fā)生串?dāng)_。
圖 1b。 圖 1b 中的兩張圖像分別顯示了通道串色（左圖），以及使用帶通光學(xué)濾色鏡抑制這種現(xiàn)象（右圖）。 在這種情況下，對(duì)微管染色的紅色染料在線粒體圖像中清晰可見(jiàn)，因?yàn)閳D像是使用多帶通熒光濾色塊采集的，但是探測(cè)器前面沒(méi)有發(fā)射光濾光鏡。 紅色染料（微管）與綠色染料（線粒體）交叉激發(fā)，導(dǎo)致通道串色嚴(yán)重。 在第二張圖像中，使用正確的發(fā)射光濾光鏡消除了串?dāng)_。
FluoSync
FluoSync 是一種快速、可靠的方法，能拆分來(lái)自樣本中多個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)。它通過(guò)相量分析簡(jiǎn)化了多光譜成像方法（Cutrale等人，2017 年），與較為傳統(tǒng)的多通道成像方法相比具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)。
FluoSync 通過(guò)探測(cè)器單次曝光同時(shí)激發(fā)和探測(cè)所有通道，從而采集多光譜圖像數(shù)據(jù)。此方法所用的探測(cè)器采用多個(gè)傳感器，每個(gè)傳感器采集光譜的不同部分。然后，使用基于相量的混合分解方法將產(chǎn)生的組合數(shù)據(jù)集分解。
由于同時(shí)采集所有熒光團(tuán)，因此它比傳統(tǒng)方法的速度更快，成為活細(xì)胞成像和微量滴定板等大型樣本成像的理想解決方案。動(dòng)態(tài)活細(xì)胞的同時(shí)成像得益于圖像采集的速度和高同步性。在采集來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同熒光團(tuán)的信號(hào)之間，囊泡等快速移動(dòng)對(duì)象不會(huì)產(chǎn)生位移。功能實(shí)驗(yàn)（例如微量滴定板等較大樣本載體上的活細(xì)胞/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）成像將受益于速度優(yōu)勢(shì)，并可將數(shù)據(jù)與另外的標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，而不需要額外的采集時(shí)間。不同于依靠多個(gè)帶通熒光濾色塊阻擋部分發(fā)射信號(hào)以改善通道分離的方法，F(xiàn)luoSync 使用寬帶濾色鏡收集大部分發(fā)射信號(hào)，提供了一種同樣適用于弱光成像的高效探測(cè)解決方案。收集的光通過(guò)內(nèi)置的光譜分離器進(jìn)行分離。因此，等人認(rèn)為基于相量的分析是一種對(duì)熒光壽命顯微成像 (FLI挑選和安裝合適的熒光濾色塊已成為歷史?；谙嗔康墓庾V拆分最初在2008年，Digman M) 進(jìn)行可視化和快速分析的有效方法。后來(lái)，F(xiàn)ereidouni 等人和 Cutrale 等人先后在 2012 和 2017 年采用了該方法。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)換為相量后可將光譜表示在徑向顏色軸上，光譜寬度確定了光譜與原點(diǎn)的距離。兩種純?nèi)玖系幕旌衔飼?huì)成為純?nèi)玖现g的一條直線，而與純?nèi)玖系木嚯x代表了對(duì)整體信號(hào)的相對(duì)貢獻(xiàn)。適用于任何兩種染料的情況也適用于更多染料。每種可能的染料組合最終都會(huì)落在相量空間中的位置。
圖 2。 概括了對(duì)含有多種熒光染料的樣本成像時(shí)的三種顏色分離方法。 通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)熒光成像方法相比，F(xiàn)luoSync 采集速度更快的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)。FluoSync 捕捉受激發(fā)染料的全發(fā)射光譜，因此光子不會(huì)被浪費(fèi)，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測(cè)技術(shù)。
圖 3。 左側(cè)所示為藍(lán)色、綠色和紅色熒光團(tuán)的三個(gè)單獨(dú)光譜。 使用相量分析時(shí)，每個(gè)純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個(gè)圓圈上表示，信號(hào)清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。 這些熒光團(tuán)的任意組合也將落入特定空間。 圖中所示是三個(gè)熒光團(tuán)中的每一個(gè)與所有三個(gè)熒光團(tuán)的混合體的一種組合。 由于任何可能的熒光團(tuán)組合也將落入“它們的"空間，因此可將光譜平均化以實(shí)現(xiàn)去噪。 右側(cè)圖是一個(gè)例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區(qū)域）。 降噪光譜表示所有貢獻(xiàn)熒光團(tuán)的總和，它很好地填充了曲線下方的面積通過(guò)相量來(lái)表示光譜信息，可對(duì)圖像中的不同熒光組分進(jìn)行實(shí)時(shí)、半盲的光譜分解。這種表示方法不僅局限于熒光標(biāo)記，還可以去除自發(fā)熒光等無(wú)用信號(hào)，因此比線性拆分更加可靠?；谙嗔康墓庾V拆分方法適合用于分解最多 3 個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)。超過(guò) 3 個(gè)熒光團(tuán)時(shí)，相量方法仍然可以輕松識(shí)別最大的影響因素。拆分領(lǐng)域的新發(fā)展催生了一種混合拆分方法，它結(jié)合了基于相量的拆分和線性拆分這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。
對(duì)混合光譜拆分的說(shuō)明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優(yōu)勢(shì)。相量分析用于相似光譜的快速聚類(lèi)以及光譜去噪和線性拆分，能夠識(shí)別染料對(duì)每個(gè)聚類(lèi)的單獨(dú)貢獻(xiàn)，甚至包括超過(guò) 3 種染料的情況（圖3）。與單純基于相量的拆分類(lèi)似，具有相似熒光組分的所有像素都會(huì)落入相同的相量空間。因此，無(wú)論空間位置（即圖像中的原點(diǎn)位置）如何，它們都可被平均化以實(shí)現(xiàn)光譜去噪。 這樣，通過(guò)歧管進(jìn)行的線性拆分操作次數(shù)（像素?cái)?shù)，通常在百萬(wàn)像素級(jí)別）通常會(huì)減到少于100,000次操作。然后對(duì)降噪光譜進(jìn)行線性拆分，由此識(shí)別每種染料的亮度值。與線性方法相比，混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優(yōu)勢(shì)，而不會(huì)影響可分離染料的數(shù)量。
總結(jié)與優(yōu)勢(shì)
FluoSync是光學(xué)濾色鏡的數(shù)字迭代進(jìn)步。這是一種可用于對(duì)多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光，并且可以使用自動(dòng)光譜分解方法完成，因此可以更輕松、更快速地進(jìn)行多色熒光成像。
與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，F(xiàn)luoSync 提供了高速、同步的多通道采集，同時(shí)利用了串?dāng)_而不是避免串?dāng)_。它是掃描大型樣本或捕捉活細(xì)胞快速動(dòng)態(tài)過(guò)程的理想解決方案。最后，使用 FluoSync 時(shí)無(wú)需在實(shí)驗(yàn)之間管理多組熒光濾色塊，從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工作流程。因此，您可以專(zhuān)注于獲得結(jié)果，而不是研究顯微鏡。
優(yōu)勢(shì)：
> 可使用不同的熒光團(tuán)組合更加自由地進(jìn)行多通道成像：您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數(shù)據(jù)生成效率： 能同時(shí)采集所有事件而無(wú)需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過(guò)程，提高了對(duì)多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強(qiáng)信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無(wú)需再擔(dān)心串?dāng)_。
參考資料
Digman MA, Caiolfa VR, Zamai M, Gratton E。用于熒光壽命成像分析的相量方法?！渡镂锢韺W(xué)雜志》，2008 年Jan 15;94(2):L14-6.
F. Fereidouni, A. N. Bader, H. C. Gerritsen, Opt. Express 2012,20, 12729
Francesco Cutrale, Vikas Trivedi, Le A Trinh, Chi-Li Chiu, John MChoi, Marcela S Artiga & Scott E Fraser. 《自然·方法學(xué)》14,149–152 (2017)
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